Các đội bóng thi đấu vòng tròn hai lượt (sân nhà - sân đối phương) để tính điểm, xếp hạng. Kết thúc giải, đội có thứ hạng cao nhất được thăng hạng, chuyển lên thi đấu tại V.League 1 2017; Các đội xếp thứ Ba và Tư sẽ play-off với nhau để chọn ra một đội tiếp tục thi đấu play-off với đội xếp thứ Nhì, đội thắng trong trận play-off thứ hai sẽ thi đấu với đội xếp hạng thứ 13 ở V.League 1 2016 thi đấu trận play-off cuối cùng để xác định vé dự V.League 1 2017. Đội xếp hạng thấp nhất sẽ phải xuống thi đấu tại Giải hạng nhì 2017.[2]

Theo điều lệ trận play-off ở mùa bóng 2016, thì để xác định đội hạng Nhất 2016 dự trận đấu tranh suất còn lại dự V-League 2017 với đại diện V-League 2016, 3 đội bóng đứng từ thứ hai đến thứ tư chung cuộc sẽ giáp mặt nhau. Cụ thể, hai đội đứng thứ ba và thứ tư sẽ gặp nhau vào ngày 27/8 tại sân đội đứng thứ ba. Đội thắng trong cặp đấu này sẽ gặp đội đứng thứ nhì ở giải hạng Nhất 2016 vào ngày 31/8 trên sân của đội đứng thứ hai. Đội thắng trong cặp đấu này sẽ giành quyền đá trận play-off với đội liền kề trước đội rớt hạng của V-League 2016. Sân thi đấu trận chung kết (play-off 3) sẽ do BTC quyết định.[3]